Использование метода ImmunoCAP в диагностике аллергических заболеваний и патологии с нарушениями в иммунной системе

Кафедра клинической, лабораторной иммунологии и аллергологии Национальной медицинской академии последипломного образования имени П.Л. Шупика

Основные причины для проведения аллерготестов in vitro

·  а) значительное поражение кожи (например атопический дерматит, распространенная форма нейродермита, экзема и др.);

·  б) повышенная аллергическая реактивность кожных покровов, которая может привести к ложно-положительным или ложно - отрицательным показателям (например при хронической рецидивирующей крапивнице, отеке Квинке, мастоицитозе и др.);

     в) невозможность проведения аллерготестов из-за необходимости частого или постоянного приема противоаллергических препаратов, которые снижают чувствительность кожи к аллергенам;

·   г) возраст: у детей и пожилых людей кожные пробы могут быть не информативны;

·   д) наличие в анамнезе анафилактоидной реакции или вероятности ее развития.

Основные преимущества проведения аллерготестов in vitro

·    а) безопасность для пациента;

·    б) возможность использования в любой период заболевания;

·     г) возможность проведения неограниченного количества аллерготестов за один раз;

·     д) результаты аллерготестов выдаются в количественном или полуколичественном виде, которая характеризует степень сенсибилизации организма данным аллергеном.

Технология ImmunoCAP®

Данная технология основана на иммунофлюоресцентном методе и отвечает основным требованиям необходимым для проведения количественных анализов:

1.             связывающая способность - в технологии ImmunoCAP® твёрдой фазой является трёхмерная активированная целлюлозная губка, которая связывается с антителами по всему объёму. Другие технологии, такие как активированные лунки планшета, активированные шарики и активированные бумажные диски для связывания используют поверхность, чем обусловлена их значительно меньшая связывающая способность

2.             позволяет тестировать наборы с большим количеством аллергенов (общие ингаляционная и пищевые панели), а для обычных наборов и индивидуальных аллергенов обеспечивает высокую точность.

Особенности технологии ImmunoCAP

Специфичность - не отмечено взаимодействия с другими иммуноглобулинами человека в физиологических концентрациях.

Чувствительность - в настоящее время пациент считается сенсибилизированным к аллергену, если концентрация антител к этому аллергену превышает 0,35 КЕ/л. Нижний предел детекции прибора составляет гораздо более малые значения, например: перхоть кошки - 0,06 КЕ/л, молоко коровы - 0,05 КЕ/л, яичный белок - 0,08 КЕ/л, берёза бородавчатая - менее 0,01 КЕ/л.

Автоматический прибор ImmunoCAP®100

Предназначается для небольших и средних лабораторий и позволяет проводить следующие исследования на пыльцевые (около 100 аллергенов), бытовые (включая плесневые грибки, эпидермальные и животные белки около 100 аллергенов); пищевые (около 200 аллергенов); насекомые и их яды (комары, муравьи, тараканы, пчелы, осы); некоторые медикаменты (амоксициллин, ампициллин, пеницилиин G и другие); профессиональные аллергены (латекс, хлорамин, формальдегид и другие).

Аппарат ImmunoCAP®100 позволяет проводить такие исследования как:

1.             Определение общего IgЕ и специфических IgЕ к аллергенам:

o    а) домашней пыли (клещи домашней пыли, таракан и др.): Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blatella germanica, Hollistier-Stier Labs;

o             б) плесневых грибков: Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Alternaria alternata, Helminthosporium halodes;

o        в) эпидермальных и животных белков: перхоть и шерсть кошки, перхоть собаки, эпителий морской свинки, крысы, мыши;

o             г) пыльцы деревьев: ольхи серой, берёзы, орешника, дуба, ивы;

o        д) пыльцы злаковых трав: ежи сборной, овсяницы луговой, плевела, тимофеевки луговой, мятлика лугового;

o   е) пыльцы сорных трав: амброзии голометельчатой, полыни, подорожника ланцетовидного, мари, лебеды;

o             д) к микстам пищевых, бытовых, пыльцевых и эпидермальных аллергенов;

Таблица 1. - Перекрёстные реакции ингаляционных аллергенов с пищевыми :
Сенсибилизирующий аллерген	Часто встречающиеся перекрёстные реакции
Пыльца берёзы	лесной орех, картофель, помидор, морковь, яблоко, груша, вишня, слива, персик, абрикос, киви, сельдерей, пастернак, кориандр, каштан
Пыльца амброзии	огурец, бананы, арбуз, мускусная дыня-канталупа, мускатная дыня
Пыльца полыни	морковь, горчица, сельдерей, пастернак, кориандр, фенхель
Пыльца трав	пшеница, другие злаки, картофель, помидор, арбуз, дыня, киви
Клещи домашней пыли	морские членистоногие и моллюски

2.Определение общего IgЕ к запатентованным супер - микстам Фадиатоп и Фадиатоп-инфант. Данные тесты разработаны компанией Phadia для проведения дифференциальной диагностики между атопическими и неатопическими заболеваниями. Фадиатоп включает в себя основные ингаляционные аллергены и позволяет с высокой вероятностью опровергнуть/подтвердить аллергическую природу респираторных симптомов у пациентов. Этот тест состоит из пыльцы деревьев и кустарников, сорных и злаковых трав, содержит клещи домашней пыли, перхоть и шерсть кошки, собаки, лошади. Фадиатоп инфант предназначен для детей и содержит смесь наиболее распространенных ингаляционных и пищевых аллергенов.

3. Количественное определение специфических IgЕ к рекомбинантным аллергенам, которые открывают новые возможности в диагностике и лечении поллинозов. Например, в аллергене пыльцы березы выделено семь белковых компонентов: патогенреактивный протеин (17 кДа), актин-связывающий протеин (15 кДа), кальций –связывающий протеин (23 кДа), кальций –связывающий протеин полькацин (8 кДа), изофлавоновая редуктаза (34 кДа), пептидилпролил изомераза (18 кДа). Рекомбинантные аллергены – это аллергенные молекулы, полученные методом генной инженерии, первоначально выделенные из аллергенного экстракта. Большинство существующих рекомбинантных аллергенов экспрессированны в клетке Esherichia coli, и по своим структурным и иммунологическим свойствам полностью соответствуют натуральным протеинам. Сегодня множество аллергенных молекул из различных натуральных источников аллергенов могут быть клонированы, секвинированы и экспрессированы как рекомбинантные аллергены. Известно, что каждый аллерген представляет собой набор антигенов – белковых компонентов, вызывающих индукцию IgЕ антител и аллергические симптомы. Традиционные аллергены представляют собой сложный комплекс белковых молекул, в разной степени ответственных за сенсибилизацию пациентов.
 Выделяют основные и минорные аллерген – компоненты. Основные аллерген – компоненты встречаются в целой группе растений, чем и обусловлена перекрестная аллергия. Минорные -характерны для определенного растения. Рекомбинантные аллергены дают возможность высокоспецифической диагностики, с помощью которой возможно определить объективные критерии для назначения АСИТ. Если аллергические реакции у пациента обусловлены сенсибилизацией к основному компоненту аллергена, то с высокой степенью вероятности можно прогнозировать высокий терапевтический эффект от АСИТ. С другой стороны. Если пациент чувствителен к минорному компоненту, то иммунотерапия будет недостаточно эффективной и даже возможно развитие новой сенсибилизации.

В настоящее время Шведская фирма «Phadia» предлагает следующие рекомбинантные аллергены:

  1.         к пыльце деревьев - береза бородавчатая (Betula verrucosa) – rBet v1; rBetv2     
          (профилирование); rBet v4; rBet v2, rBet v4;

  2.     к пыльце злаковых трав - тимофеевка луговая (Phleum platense) – rPhl p1; rPhl p6; rPhl p7;
          rPhl p11; rPhl p12 (профилирование); rPhl p1, rPhl p5b; rPhl p7, rPhl p12; rPhl p5b;
 3.    к пыльце сорных трав – постенница (Parietaria judaica) – rPar j 2

 4.    к эпидермальным аллергенам – шерсти кошки – rFel d 1

 5.    к плесневым грибкам – аспергиллез (Aspergillus fumigatus) – rAsp f1; rAsp f 2; rAsp f3; 
          rAsp f4; rAsp f6;

 6.      к продуктам питания – арахис (r Ara h8); соя (r Gly m4); креветка (rPen a1);

 7.      к профессиональным аллергенам – латексу (Hevea brasilliensis) – rHev b1; rHev b2; 
           rHev    b3; rHev b5; rHev b 6.01; rHev b 6.02; rHev b8; rHev b9; rHev b11;

Рекомбинантная технология позволяет получать аллергены, идентичные тем, которые встречаются в природе, т.к. они не подвергаются каким-либо воздействиям при их извлечении, как это бывает при использовании обычных методов экстрагирования. Это связанно с тем, что в естественных условиях и в условиях рекомбинантной технологии свойства белков таких аллергенов (последовательность расположения, характер аминокислот, их пространственное распределение) кодируются одной и той же ДНК. Указанные обстоятельства, а также достоверное определение основных и вспомогательных аллергенов, удаление из аллергенов ряда ферментов (протеаз, гиалуронидазы и др.) при помощи рекомбинантной технологии обеспечивают превосходную стандартизацию и стабильность аллергенов. При обычных методах получения аллергенов их экстракты неоднородны, они содержат одновременно аллергенные и неаллергенные молекулы, и их стандартизация может оказаться трудной. Содержание аллергенных молекул зависит и от характеристик источника. Так, пыльца березовых имеет различное аллергенное содержание у разных деревьев. Аллергенная активность плесени варьирует в зависимости от степени зрелости культуры, являющейся источником приготовления экстракта. Животные аллергенные экстракты могут иметь неодинаковую аллергенную активность, зависящую от использования различных составляющих (кожа, шкура, моча и др.). Аллергенность пищевых и других растительных экстрактов (например, яблока), может изменяться в зависимости от сорта и степени зрелости. Аллергенное содержание экстрактов зависит также от способа экстракции, очистки и хранения. Так, доочистка энзимов, нагрев и обработка может разрушить или исказить аллергенные молекулы. Некоторые аллергены растворяются в воде и не могут быть выдены классическими способами. Полноценность аллергенного экстракта, используемого для диагностики, требует, чтобы экстракт содержал одновременно главные и второстепенные аллергены.

В течение пяти последних лет было клонировано большое количество аллергенов, что позволило зарубежным производителям разработать ряд рекомбинантных аллергенов, предназначенных не только для диагностики, но и для лечения. Возможно, что аллергологическая практика в ближайшие годы будет основана на широком использовании рекомбинантных аллергенов как для диагностики так и для терапии аллергических заболеваний.

3) Определение специфических IgG и IgG4 к таким аллергенам как альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, казеин, яичный белок, плесневые грибки, клещи бытовой пыли, сывороточные белки и перья птиц, оса, пчела. Данные антитела составляют часть естественной системы иммунной защиты организма и развиваются в крови в ответ на контакт с инородными веществами. Определение специфических IgG и IgG4 к пищевым продуктам целесообразно при рецидивирующей крапивнице, атопическом дерматите, пищевой непереносимости с наличием сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта.

4) Определение клеточного маркера бронхиальной астмы эозинофильного катионного белка (ЕСР) - высокотоксичного протеина, который находится в гранулах эозинофилов и освобождается из них в ходе воспалительного процесса. Особенно информативно тестирование ЕСР у астматиков с целью мониторинга аллергического воспаления в бронхах и коррекции лечения кортикостероидами.

5) Определение другого клеточного фермента – триптазы, которая в основном содержится в гранулах тучных клеток и освобождается только при их активации. Временное повышение уровня триптазы служит клиническим маркером риска для некоторых сенсибилизированных пациентов с риском развития анафилактических реакций. Так же повышение уровня триптазы может свидетельствовать о повышении нагрузки на тучные клетки, которые возникают при ряде гематологических заболеваний .

Также данный иммунологический анализатор позволяет проводить тесты на наличие аутоиммунных заболеваний. Благодаря тем же техническим возможностям результаты тестов характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. На данном аппарате проводятся следующие тесты:

1.Диагностика целиакии: определение IgG и IgА к глиадину (спирторастворимой фракции клековины, содержащаяся в питательном веществе пшеницы, ячменя, ржи и овса), а так же IgG и IgА к тканевой трансглутаминазе (аутоантитела к компонентам поврежденной слизистой тонкого кишечника..). С июня 2010 года Европейское общество детских гастроэнтерологов, гепатологов и нутрициологов (ESPGHAN) определило новые критерии диагностики целиакии и теперь благодаря высококачественным серологическим результатам ImmunoCAP диагноз возможен без взятия биопсии.При наличии клинических признаков необходимо: определить наличие и уровень IgА к транглутаминазе (в исследованиях на аппарате ImmunoCAP100 анализ называется IgА к целиакии)и одновременно наличие и уровень IgG к глиадину.Тест считается положительным при наличии антител IgG к глиадину и повышении IgА к целиакии более 10 xULN. При необходимости проводится фенотипирование и биопсия.Первый шаг для диагностики целиакии является серологическое исследование на наличие антител. Если у пациента нет характерных клинических признаков, а есть только подозрение на наличие целиакии, то возможно положительным тестом является наличие антител IgА к целиакии более 5 xULN с дальнейшим углубленным исследованием.

2. Диагностика ревматоидного артрита: определение циклического цитрулинового пептида (цитруллинированные α- и β-цепи фибрина в синовиальной ткани, Sa-антиген, идентифицированный как цитруллинированный белок виментин, и цитруллинированные пептиды, входящие в состав коллагенов І и ІІ типа ) Ревматоидный артрит (РА) относится к заболеваниям, рано приводящим к утрате трудоспособности и снижающим продолжительность жизни. Перспективы улучшения прогноза при РА напрямую связаны с началом адекватной базисной терапии на раннем, додеструктивном этапе заболевания (не позднее чем через 3 месяца после начала заболевания). Если еще несколько лет назад этот тезис базировался в большей степени на теоретических представлениях о патогенетических особенностях ревматоидного артрита на разных стадиях его развития и небольшом массиве клинического доказательного материала, то в настоящее время получены бесспорные доказательства преимуществ такой терапевтической стратегии. Новая лечебная парадигма предусматривает постановку диагноза РА на самых начальных этапах заболевания.

3. Диагностика аутоиммунных заболеваний с помощью запатентованного компанией Phadia теста под названием Симфони, который является качественным анализом и включает в себя рекомбинантные: РНП-белки (70 кДа, А,С), В-белок центромеры человека, Rо белки (60 кДа, 52 кДа), La - белок (48 кДа), Scl -70 белок и Jo –1белки, нативные очищенные Sm – белки человека. При наличии положительного теста проводится количественное определение каждого отдельно взятого аутопротеина и уточнение диагноза. Например: антитела к Sm- антигену высокоспецифичны для СКВ, для прогрессирующего системного склероза (системной склеродермии) специфичны аутоантитела к ядерному рибонуклеопротеиду (РНП), белкам центромер и анти Scl-70. При синдроме Шегрена регистрируется позитивная реакция на ANA, а аутоантитела в основном представлены ревматоидным фактором, SSA (анти-Ro), SSB (анти-La).

Таблица 2. - Основные серологические маркеры аутоиммунных заболеваний
SSAили Ro	Растворимая (soluble) субстанция (substance) А или протеин А синдрома Шегрена или Robert-антиген (имя пациента)	протеины 52 и 60 кД связанные с молекулами цитоплазматической РНК	Неизвестно	*синдром Шегренаи СКВ *блокада сердца новорожденных в результате трансплацентарного перехода антител *SSA + , SSB+ = низкий риск нефрита*SSA+, SSB - = высокий риск нефрита
SSBили La	Растворимая (soluble) субстанция (substance) В или протеин Всиндрома Шегрена или Lane-антиген (имя пациента)	Фосфопротеины, связанные с транскриптами полимеразы III	Терминатор транскрипции хеликазы	*синдром Шегрена, СКВ*SSA + , SSB+ = низкий риск нефрита
dsDNA	Двух-цепочная ДНК	Нативная двух-цепочная ДНК свободная от протеинов	Носитель генетической информации	*СКВ, мониторинг течения* Вовлеченность ЦНС и почек
Histones	Гистоны	Базисные протеины, связанные с ДНК	Структурные элементы хроматина	Лекарственная СКВ
CENP-B	Протеин (protein)центромеры	Протеин кинетохора 80 кД	Место прикрепления микрофиламентов	Склеродермия, КРЕСТ-синдром
Jo l	Специфический протеин 1 больного с миозитом	Протеин 55кД, гистидин-тРНК синтетаза	Соединение тРНК с гистидином	*Полимиозитболее характерен, чем дерматомиозит * Ассоциирован с интерстициальной пневмонией
M-Scl-100	100 кД антиген полимиозита-склеродермы (polyniyositis -scleroderma)	Часть мультипротеинового комплекса с содержанием не менее 11 протеинов	Синтез рибосомального предшественника	Полимиозит-склеродермо-КРЕСТ- синдром
Scl-70	70 rL антиген склеродермы (scleroderma)	70 кД продукт деградации протеина с массой 100 кД	Топоизомераза I Денатурация ДНК (раскручивание)	*Склеродерма и режеКРЕСТ -синдром

Таблица 3. - Анализ маркеров аутоиммунных заболеваний.
Тип патологии	Результаты иммунологического исследования	Клиническая ценность
	Тип антител и частота их встречаемости (%)
Системная красная волчанка	* ANA 95-99% * dsDNA 50-75% *Sm 30% * RNP 25-40% *SSA(Rо) 30-40% * SSB(La) 10-15% * антифосфолипидные антитела 30-50% * PCNA 2-10% *анти-Кu (Кi) 10%	ANA и ENA - скрининг (выявление); анти-nDNA и анти-Sm — маркеры мониторинга
Дискоидная красная волчанка	Картина нормы (как правило, нормальные титры ANA)	LE-полосы в биоптатах кожи (в РПИФ)высокоспецифичны
Подострая кожная красная волчанка	* ANA 70% • SSA (Ro) > 60%	анти-SS-А(Rо) высокоспецифичны
Красная волчанка новорожденных	*ANA 70% • SS-А(Ro) 60% * SS-B(La) 60%	Анти-SS-А(Rо) высокоспецифичны
"Лекарственная" красная волчанка	*ANA > 90%* антитела против гистонов > 90% Остальные ANA и анти-ENA отсутствуют	антигистоновые антитела высокоспецифичны при отсутствии других ядерных антител
Смешанное заболевание соединительной ткани	• ANA (крапчатый тип окрашивания) > 95% • анти-RNP > 90%	Ценную диагностическую информацию дает характер окрашивания ядер в биоптатах кожи и при исследовании сыворотки крови методом непрямой иммунофлуоресценции
Синдром Шегрена	• ANA 55% . *SS-A(Ro) 43-88% .*SS-B(La) 14-60% Присутствие ревматоидного фактора(RF)	Диагноз подтверждается положительными данными серологических исследований
Склеродермия	• ANA85% (Крапчатый или ядрышковый тип окрашивания)CREST:*антицентромерные антитела 70-90% Диффузный склероз:• анти-Sсl -7045% Акросклероз:• анти-Scl-70 15-20%	*Антицентромерные антитела -маркер КРЕСТ- синдрома*Scl-70 — маркер склеродермии Диагностическая ценность прямой иммунофлуоресценции биоптатов кожи невелика
Полимиозит дерматомиозит	Общий признак: • ANA 80%Дерматомиозит:• анти-Jo-l 10% Полимиозит:• анти-Jo-l 30% • SS-А(Rо) 55% • анти-Кu(Кi) 10% (также наблюдаются при склеродермии)	Положительные результаты серологического исследования могут использоваться для подтверждения диагноза
Ревматоидный артрит	• ANA низкие титры или отсутствие • RF 90% • RANA 70-90% (присутствует в 95% сывороток не содержащих RF)	Результаты серологического исследования используются для подтверждения диагноза

Лаборатория молекулярно-генетических анализов ООО "Гермедтех"