Секвенирование ДНК по Сангеру

ДНК клетки, приступающая к делению, претерпевает кардинальные изменения: двойная спираль раскручивается, цепи расходятся. На каждой из них начинается синтез комплементарных полинуклеотидов, на одной — непрерывный, на второй прерывистый. Его катализирует фермент под названием полимераза; другой фермент, лигаза, сшивает полинуклеотидные фрагменты в непрерывную цепь. Так из одной молекулы ДНК образуются две.

Многие методы секвенирования ДНК основаны на взаимной комплементарности цепей этой молекулы. Генетический алфавит состоит всего из четырёх букв — азотистых оснований аденина (А),цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т). Основания противоположных цепей молекулы ДНК соединяются в соответствии с правилом комплементарности: А образуетпару с Т, а С — с G. В результате такого взаимодействия образуется хорошо известная двойная спираль — структура, напоминающая винтовую лестницу. Живые организмы используют принцип комплементарности при копировании своего генетического материала и устранения повреждений в нём (репарации) (см. внизу). Он же лежит в основе амплификации (1–2) целевых фрагментов ДНК и их последующего секвенирования с помощью метода, разработанного в конце 1970-х гг. Ф. Сангером.

1. Перед секвенированием по методу Сангера молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2. ПЦР состоит в следующем. Образец ДНК нагревают до температуры, при которой происходит расхождение цепей. Затем в реакционную смесь добавляют дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и праймер — короткий олигонуклеотид, комплементарный небольшому сегментуДНК-матрицы. Он гибридизуется с этим сегментом,и ДНК-полимераза последовательно присоединяет к его концу dNTP, комплементарные нуклеотидам копируемой цепи. Процесс многократно повторяют, пока не получат миллионы копий каждого фрагмента.

3. Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырём пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.

4. Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определённой длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.

источник : http://wsyachina.narod.ru/technology/sequencing_dna_1.html