Полимеразная цепная реакция

ПЦР - это осуществляемая in vitro специфическая амплифика­ция нуклеиновых кислот, инициируемая синтетическими олиго-нуклеотидными праймерами; основные ее этапы представлены на рис. 2. ПЦР-цикл состоит из тепловой денатурации ДНК, ее отжига с праймером и удлинения цепи (элонгации); смена этих этапов происходит в результате простого изменения температуры. Праймеры при этом ориентируются на матрице так, что число раундов репликации растет экспоненциально, соответственно уве­личивается и число копий специфической нуклеотидной последо­вательности.

Применение молекулярных методов для целей клинической ди­агностики ограничивается их невысокой чувствительностью и дли­тельностью анализа. Так, для выявления нуклеиновой кислоты-ми­шени методом гибридизации in situ с применением радиоактивно  меченного зонда необходимо, чтобы мишень присутствовала в пре­парате в нескольких тысячах копий. Нередко число аномальных последовательностей в клиническом препарате диагностически-значимо, но меньше этой величины и гибридизация может дать ложноотрицательный результат. В отличие от этого ПЦР позволяет выявить уникальную нуклеотидную последовательность. Для этого в реакционную смесь добавляют в большом избытке специфичные для данной последовательности олигонуклеотидные праймеры («амплимеры»), которые образуют с ней комплекс, и проводят ре­пликацию ДНК in vitro. Поскольку амплимеры гибридизуются с обеими цепями ДНК, то и нативная последовательность, и синте­зируемые ПЦР-продукты могут служить матрицами в последую­щих раундах репликации, в результате чего число копий уникаль­ной последовательности экспоненциально увеличивается (рис. 2). Благодаря этому последовательности, присутствующие в клиническом препарате в минимальном количестве (одна или не­сколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими други­ми методами, легко выявляются с помощью ПЦР. ПЦР позволяет найти всего одну аномаль­ную последовательность на 100000-1000000 нормальных клеток.

Принцип полимеразной цепной реакции изображен на рис №1. Принцип комплиментарности и антипараллельности цепей ДНК представлен на рис №3.

Рис №1.

Экспоненциальное увеличение числа копий молекулы-мише­ни не только обеспечивает высокую чувствительность метода, но и облегчает их выявление. Каждый раунд ПЦР занимает от 2 до 5 мин, и обычно для достижения необходимой чувствительности достаточно 25-50 раундов, т. е. 2-4 ч. Таким образом, весь анализ можно провести в течение одного дня по данным приведенным в [1], нам это удается за 3 ч. Кроме того, поскольку содержание ПЦР-продуктов достаточно велико, можно использо­вать неизотопные методы детекции. В табл.1 приведены дан­ные, позволяющие сравнить метод ПЦР с другими молекулярно-генетическими методами исследования. Видно, что он обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью анализа.

Рис. 2. Полимеразная цепная реакция. Праймеры подбирают таким образом, чтобы обеспечить специфическую амплификацию фрагмента ДНК определенного размера.

Таблица 1. Сравнение различных методов гибридизации

	ПЦР	Блот-гибридизация по Саузерну	Гибридизация in situ
Чувствительность	1/100000	1/100	10 мишеней
Специфичность	Высокая	Высокая	Высокая
Длительность анализа	1 сут	1 сут	1 сут

Рис. № 3. Принцип комплиментарности и антипараллельности цепей ДНК.